实验7聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验7聚丙烯酰胺凝胶电泳 本文关键词：电泳，凝胶，实验，聚丙烯酰胺

实验7聚丙烯酰胺凝胶电泳 本文简介：实验7聚丙烯酰胺凝胶电泳原理一聚丙烯酰胺凝胶电泳

＜104

15~20%

104~105

5~10%

105~2×106

2~***

聚丙烯酰胺凝胶的网孔大小、机械强度、弹性均由胶的总浓度与Bis的浓度比及聚合的条件来决定。

孔径与总浓度有关，总浓度越大，孔径则相应变小，机械强度增强；总浓度越小，则相反。当总浓度不变时，甲叉双丙烯酰胺

Tris

***,Gly

36g,用水定容到250ml

凝胶贮液

Acr

***,Bis

***,用水定容到30ml

分离胶缓冲液

T***,,H2O120ml,用浓HCl调到pH8.8，用水定容到150ml

浓缩胶缓冲液

T***,,H2O140ml,用浓HCl调到Ph6.8，用水定容到150ml

3.

不同浓度

贮液

凝胶浓度

5%

***

***

***

***

L(ml)

6.3

6.3

6.3

***

6.3

N(ml)

4.3

6.2

8.4

10.5

12.6

H2O(ml)

14.6

12.5

10.4

8.3

6.2

TEMED(μl)

10

10

10

10

10

Ap(mg)

20

20

20

20

20

4.

浓缩胶配方

M

N

H2O

TEMED

Ap

***

***

***

5μl

10mg

三

凝胶系统和制胶

垂直板型电泳的凝胶系统有两类。一类是不连续系统，主要用于蛋白质的分离；另一类是连续系统，只有一层凝胶，一种pH和一种缓冲系统，将样品透析或稀释，使样品的电导很低，这样人工造成电位梯度差异，也可使样品浓缩，达到同样分辨力。

近年来在蛋白质和核酸的凝胶电泳研究中，广泛使用着这种连续系统。

1.分离胶的制备：将贮液由冰箱中取出，达到室温后，按表中的比例配制工作溶液，

分离胶先不要和过硫酸铵混合，分别放在真空干燥器中抽出溶解的空气，取出赶快

混匀，灌入玻璃板之间的空隙，达到合适的高度后，用细滴管在已经加好的分离胶

上面加3~5mm高的水层。

加蒸馏水的目的，除隔离空气中的氧外，并能消除分离胶

图B

表面的曲度，使凝胶表面平坦，否则会影响带形和分辨率。因此着一步操作要特别

小心，尽量防止水与胶液的混合。

注意不要打搅凝胶液面，切忌加水时成滴状坠入

胶液，这样会使顶部凝胶浓度变稀，以致改变预期的凝胶孔径，或从而造成凝胶表

面的不平坦。即使小心地操作，凝胶顶端约1~3mm有时也受影响，往往凝聚不良或

孔径改变，使这一区域内所形成的区带的迁移率值不可靠。

水层放好后，静置胶液进行聚合反应，聚合时温度要与电泳时的温度相同，正常情况下10分钟即开始聚合，应控制在30~60分钟聚合完成。

刚加水时看出有界面，随后逐渐消失，等到再看到界面时，表明凝胶已经聚合。

再静置30min使聚合完全。

2.浓缩胶的制备：当分离胶完全聚合后，甩去分离胶表面的水层，用滤纸条

蛋白质的一般染色方法见下表

蛋白质的染色方法

方法

固定液

染色液

染色时间

脱色液

氨基黑10B

甲醇

7%乙酸

***L

NaOH中1%氨基黑

7%乙酸中***氨基黑

5min

(RT)

2h(RT)

5％乙醇

7%乙酸

考马斯亮蓝R250

20%磺基水杨酸

10%三氯乙酸

样品中含尿素的在5%三氯乙酸中固定

***R250水溶液

10%三氯乙酸-1%

R250=19：1

5%磺基水杨酸和1%R250=19：1

5min(RT)

30min

(RT)

1h

(RT)

7%乙酸

10%三氯乙酸

90%甲酸

考马斯亮蓝G250

6%乙酸

***三氯乙酸

6%乙酸中1%G250

***三氯乙酸中***G250

10min

(RT)

30min

(RT)

甲醇：水：浓氨水=64：36：1

(2)银染色法：此方法灵敏度高，适合于微量样品分析。

①

电泳后立即将凝胶浸泡在固定液（500ml乙醇、100ml冰乙酸、400ml蒸馏水）中，至少30min，如有必要，凝胶可在固定液中过夜。

这一步可使蛋白质沉淀，并使SDS从凝胶中扩散出来。

②

将凝胶放在浸泡液中（75ml乙醇、***乙酸钠、戊二醛（25%W/V）、***硫代硫酸钠（5H2O），用蒸馏水溶解后定容到250ml）中30min

。

③

用蒸馏水洗3次，每次5min。

④

将凝胶在银溶液（***硝酸银、50μl甲醛、加蒸馏水至250ml）中放置20min

.

⑤

在显色液（***碳酸钠、25μl甲醛，以蒸馏水溶解后，定容至250ml）中放置2~10min。

视蛋白带显示深棕色为止。

⑥

为终止反应，将凝胶放在终止液（***

EDTA-Na.2H2O，用蒸馏水定容到250ml）中10min

。

⑦

用蒸馏水洗3次，每次5~10min

。

⑧

如欲保存，将凝胶在保存液（25ml87%甘油，用蒸馏水加至250ml）中放置20~30min

，然后将凝胶放在玻璃板上，再用保存液浸湿的玻璃纸包住凝胶在室温下凉干。

注意不要将凝胶加温，这样会使银染色漂白。

以上银染色的每一步都应在日光下进行，并且均匀地震荡，银染色用的试剂纯度以及蒸馏水的纯度都极大地影响银染色的质量。如聚合的甲醛或戊二醛不能使用。

要用蒸馏水做进一步的无离子处理，最好使用超纯水。

8.脱色及保存

将染色的凝胶放入脱色液中，轻轻地振摇脱色，经常更换新溶液，直到染料不再洗出，背景几乎无色为止。

脱色后的凝胶放在7%醋酸溶液中

，可以长期保存。

试剂和器材

1.

丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺：一般用电泳做定性分析工作，用分析纯的Acr和Bis，即可获得满意的结果。无需对试剂做进一步的纯化。

Acr和Bis不纯时（主要杂质是丙烯酸）会使聚合不均一，或聚合时间延长甚至不聚合。

对于精细的分析工作，尤其是定量分析工作和制备工作，要求严格的可重复性或要求在波长260~280nm无吸收，就需要纯度更高的Acr和Bis

，可将商品的Acr和Bis重结晶。

Acr

重结晶方法：将Acr溶于50℃氯仿中（70g/L），热过滤。冷却到－20℃结晶，用冷的布氏漏斗过滤收集结晶。用冷氯仿淋洗，真空干燥。Acr的熔点为84.5±0.3℃。

纯化的Acr水溶液的pH是***。只要此pH值变化不大于***H单位，就可使用。

反复进行这一重结晶过程，并不能绝对纯化Acr。因为

Acr的水溶液（尤其是碱性时）总不断水解放出丙烯酸和NH3、NH4+，使pH略有下降。用离子交换技术可除去丙烯酸，但过程复杂，无此必要。

Bis

的重结晶：将12gBis溶于40~50℃的1000ml丙酮中，热过滤。慢慢冷却到－20℃，过滤或离心收集结晶。用冷丙酮洗涤后，真空干燥。

Bis

的熔点为185℃。

试剂的贮存：固体Acr和Bis需贮存于棕色瓶中，保持干燥和较低温度（4℃最好）是相当稳定的。

如保存不当，在超声波、γ-辐射或天然光作用下，Acr自身能聚合成链、（烯基间反应）。

酰胺基也会进行缩合，形成亚胺桥而交联，试剂失效。

Acr和Bis

的贮液，会由于水解作用而形成丙烯酸和NH3。

溶液装在棕色瓶中，贮于冰箱（4℃），能部分地防止水解。但也只能贮存1~2个月。可测pH值（***）来检查是否失效。失效溶液不能聚合。

Acr和Bis是神经性毒剂，同时对皮肤有刺激作用。操作时要十分小心，避免与皮肤接触。大量操作时（如纯化）可在通风橱内进行。

Acr的半数致死量（对小鼠）LD50=170mg/kg。

2.

N，N，Nˊ，Nˊ-四甲基乙二胺（TEMED）：应密封避光保存。

3.

过硫酸铵溶液：最好当天配制。在冰箱中贮存也不能超过一星期。

器材：

1.

电泳仪直流稳压电源

2.

垂直板型电泳槽及配套的制胶模具。

附：

一

蛋白质超薄凝胶电泳

电泳技术是利用带电粒子在电场作用下以不同的速度向电荷相反方向运动的现象来对某些化学或生物化学组分进行分离分析的，它已经成为生物化学和分子生物学实验中对蛋白质和核酸分子进行检测的最常规工具。目前蛋白质电泳通常采用垂直平板，分离介质为聚丙烯酰胺凝胶，凝胶厚度一般在***。但由于电泳过程中产生的焦耳热，将在凝胶中央产生一个径向的温度梯度，从而导致带电粒子产生径向的移动梯度，结果使区带展宽，减低分辨率。凝胶越厚，径向温度梯度越大，电泳条带越宽，所以凝胶厚度是影响电泳分辨率的一个主要因素。降低厚度到***以下，在染色和照相过程中容易使胶破碎，而且容易粘板。如果直接对电泳方板进行化学处理，为其涂渍一层亲水性的薄膜，在凝胶过程中，该膜上所带的双键也参加聚合，因此能够牢固地结合聚丙烯酰胺凝胶，从而克服了凝胶粘板的情况。

方板的亲水性处理

将方板在10%的NaOH中浸泡1h，洗洁精彻底清洗，流水冲净，去离子水中洗3次，凉干；乙醇擦拭，凉干；

用擦镜纸沾取改性液（1ml95%乙醇加入10μlMAPS和10μl冰醋酸），均匀涂布玻璃板表面，静置10min，再用擦镜纸沾取95%乙醇单向擦拭玻璃板，然后在沿垂直方向擦拭，重复3次此擦拭过程，凉干。

凹板的硅烷化处理

将凹板用清水、洗洁精和去离子水彻底清洗，烘干；乙醇擦拭，凉干。

以滤纸沾取硅烷化溶液（7%二氯二甲基硅烷的氯仿溶液）均匀涂布玻璃板表面，烘干，水清洗，烘干；乙醇擦拭，凉干。

制胶和电泳

将处理好的玻璃板夹上***厚的夹条，装在制胶架上，按常规PAGE制胶的方法灌制凝胶。

注意事项

1.

玻璃板的清洁程度至关重要，一定要彻底清洗，一种最重要的判断方法是，当用乙醇擦拭玻璃板时如果出现彩晕，则表明玻璃板已经洗净。

2.

如果在灌胶时发生漏夜，需要重新处理两块玻璃板，这是因为MAPS能够通过水溶液污染凹板，在起胶时容易撕裂凝胶。

3.

最好每次实验都用NaOH处理方板，因为玻璃板表面硅羟基多以—Si—O—Si—状态存在，对硅烷化呈惰性反应，NaOH能使表面硅羟基更多地以—Si—OH形式存在。

4.

MAPS也可以用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷（KH-550化学纯）代替。

二

利于蛋白质回收的染色脱色方法

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和由等电聚焦（IEF）、SDS-PAGE组成的双向电泳不仅是分析、分离蛋白质的常用方法，而且也逐渐成为制备蛋白质的有效手段：从凝胶中制备的蛋白质可以用于蛋白质的测序或制备抗体等。

但现在常用的染色-脱色方法不仅耗时长，而且由于冰醋酸的作用而不利于蛋白质从凝胶中洗脱回收。下面介绍一种利于蛋白质回收的方法。

染色方法凝胶先用染色液(

***考马斯亮蓝R-250、50%乙醇、7%冰醋酸)振荡染色20min，然后用蒸馏水反复冲洗后，浸入250mmol/L

KCl溶液中，直到背景清晰为止。

蛋白质的电泳洗脱

用锋利刀片切取含目的蛋白的凝胶后，将它们放入透析袋中，加入适量洗脱液（25mmol/L

Tris,192mmol/L甘氨酸，***SDS，pH8.3）后，在水平电泳槽中恒流80mA进行电洗脱，直到凝胶无色为止，约需2.5小时。

在洗脱液中按1∶20（体积比）加入冷丙醇，在－20℃静置30min后于4℃、***g离心20min,沉淀在室温下放置挥发掉丙酮后加入适量的SDS-样品溶解液，用分离胶为***SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检查洗脱效果。

三

简便的考马斯亮蓝G250蛋白质染色方法

蛋白质电泳后染色方法有多种：氨基黑染色、考马斯亮蓝染色和印染色等。

其中考马斯亮蓝染色克服了氨基黑染色灵敏度较低和银染法操作复杂、假阳性率高的缺点，是最常用的方法，但它仍存在一些问题，如考马斯亮蓝R250（CBB

R250）背景深、耗时长；CBB

G250灵敏度不高；二者所耗试剂均较多等。

考马斯亮蓝CBB

G250蛋白质染色方法，是一种经济快速、灵敏度高、几乎无背景的蛋白质染色方法。

此种染色方法适用于SDS-PAGE和常规PAGE，而用于IEF凝胶染色则效果较差。

该种染色方法历时短，5~10分钟即显现蛋白质条带而可进行初步观察，2小时染色达70%，4小时后染色基本达到饱和，染色背景颜色不深，漂洗***小时即可完全脱去背景色。

染色液配制：

1mol/L盐酸溶液（A），1g/L

CBB

G250溶液（B）；使用时用1mlA

液和15ml

B液混合加水至1L，搅拌混匀。

染色程序：

1.

电泳完毕后，取出凝胶浸于5mmol/L盐酸溶液中，振荡1小时。

2.

弃去盐酸溶液，重复操作1。

3.

将胶置于染色液中，染色2~16小时，连续振荡。

4.

弃去染色液，将胶置于1mmol/L盐酸溶液中脱色数小时（换液3~5次）后，即可进行结果观察和照相，并将凝胶保存在1mmol/L盐酸溶液中。