Simone
这个问题其实涉及到了双筛选的问题。以最简单的大肠杆菌T克隆为例，T克隆中常用的T载体上带有一个青霉素抗性基因，然后还有一个β－半乳糖苷酶N端141个氨基酸的编码基因（LacZ'），而我们常用的大肠杆菌表达系统中所使用的工程菌，它们的基因组里面本身含有β－半乳糖苷酶C端其他氨基酸序列的编码序列。但无论是质粒载体上的N端片段也好还是基因组本生的C端片段也好，单独存在的时候都没有任何活性。只有这两者都存在的时候，才会互补形成有活性的β－半乳糖苷酶。而这个酶可以分解一种叫做X－gal的乳糖类碰滑似物，使得菌落形成蓝色。在载体上的这部分lacZ'编码序列前端插入一个小片段是不会影响到它的互补活性的，所以多克隆位点的碱基序列就被插在了这里。但如果在这之间插入一个大片段，那么这就会导致lacZ'失活。所以，我们在完成质粒重组后，将这些质粒转入大肠杆菌，然后在含有青霉素的培养基中加入X－gal和lacZ'表达诱导物IPTG，如果是质粒自连接的话，那么就会产生有完整活性的β－半乳糖苷酶，最后形成蓝色菌落。而对于插入成功的重组质粒，那么就不会产生有活性的β－半乳糖苷酶，最后形成的是正常的白色菌落。这就是最经典的α互补，也叫做蓝白筛选，现在大肠杆菌表达系统的重组子筛选所用的原理，基本上还是这个。但这个方法并不能百分百保证是正确插入片段，还要有下游操作进一步验证。比如酶切鉴定和PCR鉴定。 简单来说质粒上除了抗性基因还有一个基因，抗性基因证明质粒是否转进去。另外一个基因笑虚腊证明片段有没有插进去。插进去的片段都是位于这个基因编码序列内部，如果插进去了，这个基因就失活了，没插进去就有活性。这个有活性的基因能够降解X－gal这种物质使菌落变成蓝色，如果没有活性就不能。楼誉中下说的其实意思就是用两种内切酶分别切质粒和目的片段，使它们末端带有不同的粘性末端，这样质粒就很难发生自连了。加上重组筛选和后面的下游鉴定，基本上就没有任何问题了。
